华盛顿大学团队用 AI 设计可切割特定蛋白质的蛋白酶

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AI 设计工具制造出能破坏数百年稳定化学键的蛋白质。

蛋白质是一条由肽键连接起来的氨基酸链。就其本身而言，这些键极其稳定；据估计它们的半衰期长达数百年。但在地球的环境中，大多数蛋白质远撑不了那么久。这是因为生物体已经演化出若干种催化肽键断裂的方式，这些方式又多样化成无数专司消化蛋白质的酶。蛋白酶无处不在，通常能迅速分解任何进入环境的蛋白质。

如今，研究人员基本上走了一条捷径，绕过了这一多样化过程：他们使用基于 AI 的蛋白质设计工具，提取两种蛋白酶的催化核心，并替换掉蛋白质的其余全部部分。由此得到的酶可以被调校用来把特定蛋白质一切为二，研究人员还通过切割与神经疾病相关的蛋白质展示了它们的有效性。

切割蛋白质

基本的肽键看起来并不特别有趣——它就是把一个氨基连接到一个酸基上，并在这一过程中释放一个水分子所得到的东西。顾名思义，氨基酸同时拥有氨基和酸基，这使它们能在氨基酸的两侧形成肽键。这对于构建蛋白质中的长链至关重要。（氨基酸还具有带有独特化学性质的侧链，这赋予了骨架特定的特性。）

打断这些键只是把这一过程反过来：破坏肽键和水分子，并把它们的组成部分重新连接起来。由于这两个组分在化学上都很稳定，该反应需要酶的作用才能以任何可观的频率发生。

生命演化出了若干种实现这一催化的酶机制。本文所涉及的研究依赖其中两种不同的机制。一种是 锌蛋白酶，其中锌原子的正电荷协调着正在被切断的肽键、蛋白酶的关键部分以及一个水分子。蛋白酶部分地从水分子上夺走一个质子，将其激活以攻击并打断肽键。

研究人员使用的第二种蛋白酶被称为 半胱氨酸蛋白酶。在这种情况下，酶中的一个半胱氨酸（一种氨基酸）被激活以攻击肽键，形成一个临时的中间体，其中被切割的蛋白质的一部分与酶形成化学连接。最终一个水分子会破坏这个中间体，释放出被切蛋白质的另一部分。

这两种机制都要求蛋白酶的少数特定氨基酸位于蛋白酶催化中心内的相近位置。蛋白酶中的其他氨基酸则帮助确保这些关键的催化氨基酸以正确的方向聚在正确的位置。蛋白酶的其余部分也可能对切割哪些蛋白质施加一定的特异性。有些蛋白酶，比如在我们消化系统中活跃的那些，可以在任意氨基酸旁边进行切割。另一些则稍微更有选择性，偏好切割带正电或带负电的氨基酸附近。还有少数具有极高的特异性，例如激活胰岛素的蛋白酶，它只在一段非常特定的氨基酸序列附近切割。

设计酶

这项新工作背后的研究人员，主要来自诺贝尔奖得主 David Baker 在华盛顿大学的实验室，将设计蛋白酶视为一项挑战。一方面，肽键的稳定性意味着没有高效的催化剂反应就不会发生。而要得到这样的催化剂，需要特定氨基酸的极其精确的排列。因此，该实验室开发的 AI 蛋白质设计工具是否能胜任这项任务并不明确。

两个项目采用了类似的方法。就像进化一样，它们从现有的蛋白酶开始。一种是螯虾消化系统中使用的一种锌蛋白酶。另一种是来自酵母的半胱氨酸蛋白酶。在这两种情况下，蛋白质结构都是已知的，催化切割其他蛋白质的关键氨基酸也是已知的。设计过程从这些氨基酸开始。

设计过程从名为 RFdiffusion2 的软件开始，它为酶创建一个骨架（骨架由蛋白质中重复的肽键构成）。研究人员给 RFdiffusion2 设定了一系列约束条件。首先，它设计的任何骨架都必须将功能性蛋白酶所需的关键催化氨基酸聚集在一起。他们还给了它一个目标氨基酸序列，即蛋白酶最终将切割的位置。骨架必须使该目标序列位于催化中心附近。

骨架确定后，下一步使用 ProteinMPNN，这是一种沿骨架工作、为其填充特定氨基酸的工具。（该工具曾出现在 Google 为 AI 设计的蛋白质添加水印的努力中。）ProteinMPNN 基于一系列约束条件来选择每个氨基酸。首先，氨基酸必须与骨架折叠成其预定结构相兼容。其次，在关键区域，所选择的每个氨基酸需要与酶催化位点的形成相兼容。最后，在附近的区域，它必须与结合预期目标相兼容。

研究人员对半胱氨酸蛋白酶和锌蛋白酶都重复了这一过程数十次。对于半胱氨酸蛋白酶，他们制作了 12 种不同的骨架，并用 69 组不同的氨基酸填充它们。对于锌蛋白酶项目，他们尝试了 135 种不同的蛋白质设计。他们使用 AlphaFold3 预测了其中许多设计的结构，并在数据库中找不到与它们相似的结构，证实他们的工具并非简单地在窃取先前已确定的结构。

它们有效吗？

研究人员首先制造了一种单一的长蛋白质，其中包含蛋白酶、它被设计用于靶向的序列以及一种荧光蛋白。然后他们测试荧光蛋白是否被切离。在半胱氨酸蛋白酶的情况下，他们得到了13个有效设计，成功率为19%，尽管所有设计的活性都远低于作为模型的酵母酶。

锌项目则更为复杂。他们测试了许多不含通常参与该反应的水分子的设计。这些设计的成功率相对较低，89个设计中只有14个显示出微弱的催化活性。当他们对那些无效的设计进行建模时，发现这些设计常常让一个水分子堵住了反应应该发生的位点。

因此，他们还尝试了将水分子放置在正确位置作为额外设计约束的设计。这些设计的成功率要高得多，38个设计中有35个显示出一定的催化活性。然而，它们的活性同样远低于作为设计起点的酶。（他们确实得到了一个活性较好的设计，但它对切割其他蛋白质的位置不具有特异性。）

为了探究这种活性能否得到改善，研究人员识别出那些靠近蛋白酶活性位点但不直接参与催化的氨基酸。他们将每一种预计不会破坏设计结构的替代氨基酸都替换了进去。他们发现了一些活性明显更高的版本；他们确定的最佳版本将肽键的切割速度提高了10⁹倍，同时仍对预期的目标蛋白序列保持高度特异性。

锌基蛋白酶也发生了类似的事情。他们蛋白酶的v2版本融入了一些随机突变，其活性是基于的原始设计的30倍。它还将肽键的切割速度提高了10¹⁰倍。

作为对这种方法前景的最终展示，研究人员设计了能够靶向与神经系统疾病（如阿尔茨海默病和额颞叶痴呆）相关蛋白质的锌蛋白酶。尝试修改他们现有的设计来靶向新序列的效果并不理想，因此他们从头重新开始了这一过程，并成功找到了能够在细胞中切割预期靶标的东西。对于研究人员而言，这表明我们最终或许能够通过靶向导致某些遗传疾病的畸形蛋白来影响这些疾病的进程。

这些结果告诉了我们什么？

这方面的潜在治疗用途很复杂。蛋白质通常难以递送到它们所需的作用部位，并且常常可能触发免疫反应。如果蛋白酶的靶标位于细胞内部而非外表面，情况就更具挑战性了。这可能需要靶细胞自己制造这种蛋白酶，这就涉及将编码它的基因递送到需要它的细胞中。因此，在我们有可能开始利用这项技术开发疗法之前，还有相当多的障碍需要克服。

研究人员还强调了这项工作如何揭示了这些工具的一些局限性。就目前的使用方式而言，它们成功设计出的蛋白质满足了所有给定的物理约束：这些蛋白质折叠成的结构能把催化反应所需的氨基酸大致带到正确的位置，并能与特定的目标氨基酸序列结合。

但目前我们还没有能力告诉这些工具我们想要任何特定的催化活性。因此许多设计缺乏一些微妙的细节，而这些细节正是让进化出的酶成为如此优秀催化剂的关键。换句话说，这些工具擅长结构，但不一定擅长活性。虽然结构对功能至关重要，但结构并非一切。正如研究人员所看到的，引入随机突变仍然可以进行微妙的结构调整，从而产生活性显著更高的酶。

当然，这款蛋白质设计软件问世才几年，开发者和用户可能会想出办法来纳入物理位置之外的其他约束条件。

John 是 Ars Technica 的科学编辑。他拥有哥伦比亚大学生物化学学士学位，以及加州大学伯克利分校分子与细胞生物学博士学位。当与键盘物理分离时，他往往去找一辆自行车，或找一个风景优美的地方与他的徒步靴亲近。

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